分子植物科学卓越创新中心上海植物逆境中心通过 all-in-one策略及TMV Ω翻译增强子序列实现基因精确敲入

文章来源:分子植物科学卓越创新中心/植物生理生態研究所  |  发布时间:2019-09-30  |  【打印】 【關閉

  

  2019年9月25日,Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了来自中國科學院分子植物科学卓越创新中心上海植物逆境生物学研究中心Daisuke Miki研究组和朱健康研究组合作的题为“Gene targeting in Arabidopsis via an all-in-one strategy that uses a translational enhancer to aid Cas9 expression”的研究论文。该研究在原来的基础上,实现了一步到位(all-in-one)的基因打靶方法。

  在该研究中,将Cas9蛋白、gRNA和HR修复供体序列一次性全部设计在同一个载体上进行一次转化(如下图所示)。此外,该研究还增加源于TMV的Ω翻译增强子序列以增强Cas9蛋白的表达,在HR供体序列两侧增加sgRNA识别位点及使用具有EC1.1启动子的嵌合EC1.2 / DD45增强子来驱动Cas9表达。

  該研究發現,在不使用增強子等元件的條件下,基因敲入的效率只有0.68%。而通過利用源于TMV的Ω翻譯增強子序列增強Cas9蛋白的表達,在DD45啓動子的驅動下,能將基因敲入的效率提高3倍,達到2.4%。此外,研究發現,EC1.2/DD45的增強子配合EC1.1啓動Cas9蛋白的表達,在該體系中並沒有效果。在HR供體序列兩側增加sgRNA識別位點,也不能增加基因敲入的效率。

  該研究表明,盡管使用all-in-one策略進行基因打靶的效率低于兩步法的效率,但是在未來的工作中,將進一步優化all-in-one策略,提高基因打靶的效率,使其能更高效地應用于擬南芥的任一生態型或者基因組背景植株,或其他能使用浸花法轉化的高等植物。

  本研究得到了中國科學院的资助。彭方楠硕士和张文心硕士为论文的共同第一作者,Daisuke Miki研究员和朱健康研究员为论文的共同通讯作者。

  論文鏈接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/pbi.13265